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一、檢測(cè)前準(zhǔn)備?

1.??試劑回溫?
檢測(cè)前1小時(shí)將所有試劑（酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、抗體等）從4℃取出，置于室溫（20~25℃）平衡，使用前需搖勻液體試劑?。

2.??洗滌液配制?
將20×濃縮洗滌液按1:19比例用蒸餾水稀釋（如1mL濃縮液+19mL水），若有結(jié)晶需37℃加熱溶解?。

3.??樣本前處理?

1.??谷物/飼料?：粉碎樣品過(guò)20目篩，稱取5.0g加入25mL提取液（80%甲醇水溶液），振蕩3分鐘，靜置后取1mL上清液離心（4000rpm，2分鐘）?。

2.??液體樣本?：取1mL樣品與9mL稀釋液混合，離心后取上清?。

3.??提取液稀釋?：按1:10比例稀釋上清液（如100μL上清液+1000μL稀釋液）?。

二、檢測(cè)步驟?

1.??加樣與反應(yīng)?

1.?在預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板微孔中依次加入：

1.?50μL標(biāo)準(zhǔn)品/處理后的樣本（平行雙孔）?；

2.?50μL酶標(biāo)記物（HRP標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)抗原）?；

3.?50μL抗體工作液?。

2.?室溫（25℃）避光孵育30分鐘?。

2.??洗板?
倒掉孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液注滿微孔，靜置30秒后甩干，重復(fù)5次，最后一次拍干殘留液體?。

3.??顯色與終止?

1.?每孔加入100μL TMB底物（A液+B液等體積混合），避光孵育5~10分鐘（顯藍(lán)色）；

2.?加入100μL終止液（2M硫酸），溶液變黃色，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)讀取OD值?。

三、結(jié)果計(jì)算?

1.??標(biāo)準(zhǔn)曲線制作?
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、150ppb）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)曲線?。

2.??樣本濃度計(jì)算?
根據(jù)樣本OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（如谷物樣本通常稀釋20倍）?。

四、注意事項(xiàng)?

1.??溫度控制?
全程保持室溫（20~25℃），溫度過(guò)高或過(guò)低影響顯色靈敏度?。

2.??操作時(shí)效性?

1.?酶標(biāo)板開(kāi)封后需1小時(shí)內(nèi)使用；

2.?終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成讀數(shù)?。

3.??安全防護(hù)?
終止液含強(qiáng)酸，避免接觸皮膚；標(biāo)準(zhǔn)品含毒素，操作時(shí)戴手套?。

4.??結(jié)果驗(yàn)證?
陽(yáng)性樣本需用色譜法等確證。