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采用實時熒光PCR技術(shù)，針對蠟樣芽胞桿菌特異性基因設(shè)計引物和探針。PCR擴增過程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號繪制出實時擴增曲線，從而實現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌在核酸水平上的定性檢測。

1、核酸提取????????

新鮮培養(yǎng)物：

使用商品化的核酸提取試劑盒或其他驗證過的核酸提取方法進行核酸提取。

純培養(yǎng)菌株：刮取一環(huán)純培養(yǎng)菌落，懸浮于100μL的無菌水中，漩渦震蕩10s（如果菌落未能均勻分散，可適當(dāng)延長震蕩時間），95℃或沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，吸取上清。

2、反應(yīng)體系配置

從試劑盒中取出BC預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后將陰性對照、樣品的DNA提取液、陽性對照各取5μL分別加入PCR管或PCR板中，蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

3、PCR擴增???????

PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM。

注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。